Mostrar código-fonte de PCR quantitativo em tempo real

Na [[Biologia molecular|Biologia Molecular]], o '''PCR em tempo real''' (do inglês: real-time ''polymerase chain reaction''), também conhecido como PCR quantitativo (qPCR) é uma técnica de laboratório baseada no princípio da [[reação em cadeia da polimerase]] (PCR). O procedimento monitora os níveis de [[Ácido nucleico|ácidos nucleicos]] durante a amplificação, diferentemente do PCR convencional no qual a quantificação ocorre somente após o final da amplificação.

A reação em cadeia de polimerização em tempo real combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por fluorescência. A metodologia permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA sejam realizadas em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados e diminuindo o risco de contaminação da amostra e dando maior precisão.

== Princípios do PCR ==
O PCR permite a amplificação de um segmento específico de DNA a partir de uma mistura complexa de DNA contendo uma pequena quantidade do material de interesse<ref name=":0">{{Citar periódico |titulo=Polymerase Chain Reaction |acessodata=2021-01-06 |publicado= |ultimo2=Avashia |primeiro2=Nidhi |ultimo=Garibyan |primeiro=Lilit |doi=10.1038/jid.2013.1 |numero=3 |url=https://dx.doi.org/10.1038/jid.2013.1 |pmid=23399825 |pmc=4102308 |paginas=1–4 |issn=0022-202X |data=2013-03 |jornal=Journal of Investigative Dermatology |pagina=}}</ref>. O protocolo exige a presença da amostra a ser analisada, [[Iniciador|primers]], [[DNTP|dNTPs]] e [[ADN polimerase|DNA polimerase]]<ref name=":0" />. Geralmente, a amostra a ser analisada consiste no DNA complementar (cDNA) resultante da [[Retrotranscrição|transcrição reversa]] do RNA. Os primers são fragmentos curtos de DNA de fita simples, complementares à sequência de interesse. Geralmente há um primer ''forward'' e um primer ''reverse.'' Os dNTPs são os nucleotídeos livres ATP, GTP, TTP e CTP, que contém as bases adenina, guanina, timina e citosina, respectivamente. A DNA polimerase é a enzima que catalisa a síntese do DNA, e é geralmente isolada da [[bactéria]] [[Organismo termófilo|termofílica]] ''Thermus aquaticus''.

A mistura contendo os componentes mencionados acima são submetidos a vários ciclos em um termociclador. Cada ciclo possui três etapas<ref>{{Citar livro |url=https://www.worldcat.org/oclc/986827885 |título=Lehninger principles of biochemistry |ultimo=Nelson, David L. (David Lee), 1942- |ultimo2=Lehninger, Albert L. |edicao=Seventh edition |local=New York, NY |oclc=986827885}}</ref>: 

1 - [[Desnaturação do ADN|Desnaturação]] (''melting''), com aumento de temperatura, para que as duas fitas do cDNA se separem.

2 - Anelamento (''anneling''), com diminuição da temperatura, para que os primers pareiem com as sequências-alvo no DNA.

3 - Síntese, na qual a temperatura é a ideal para a atividade da DNA polimerase. A sequência reconhecida pelo primer é replicada.

Estes ciclos ocorrem de 30 a quarenta vezes, até que a sequência de interesse esteja suficientemente amplificada.

== Métodos de detecção no qPCR ==
Os métodos mais comuns de detecção no qPCR são (1) corantes fluorescentes que se ligam a DNA de dupla fita e (2) sondas específicas a certas sequências de DNA<ref name=":0" />.

Quanto ao primeiro método de detecção, o corante mais utilizado é o SYBR Green, que emite uma [[fluorescência]] maior quando ligado ao sulco menor do DNA de dupla fita, em comparação ao corante livre na solução<ref name=":1">{{Citar periódico |titulo=Comparison of SYBR Green and TaqMan methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes |lingua=en |publicado= |ultimo3=Javanmard |primeiro3=ShaghayeghHaghjooy |ultimo2=Panjehpour |primeiro2=Mojtaba |ultimo=Tajadini |primeiro=Mohamadhasan |doi=10.4103/2277-9175.127998 |url=http://www.advbiores.net/text.asp?2014/3/1/85/127998 |acessodata=2021-01-06 |numero=1 |pmid=24761393 |pmc=3988599 |paginas=85 |issn=2277-9175 |data=2014 |jornal=Advanced Biomedical Research |pagina=}}</ref>. Deste modo, quanto maior a quantidade de DNA de fita dupla em solução, maior o sinal fluorescente. O SYBR Green é não-específico, de modo que pode se ligar a qualquer sequência de DNA de fita dupla. O seu pico máximo de excitação ocorre a 497nm, enquanto o pico de emissão ocorre a 520nm<ref>{{citar web |ultimo= |primeiro= |url=https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/Datasheet/s9430dat.pdf |titulo=Product information - SYBR Green I nucleic acid gel stain |data= |acessodata=06-01-2021 |publicado=Sigma-Aldrich}}</ref>. 

Em relação ao segundo método de detecção, o método mais conhecido é o TaqMan. O protocolo exige uma DNA polimerase com atividade [[nuclease]] 5’ e uma sonda. A sonda consiste em curto [[oligonucleotídeo]] de fita simples específico contra o fragmento de interesse, com um [[fluoróforo]] repórter em sua extremidade 5’ e um ''quencher'' em sua extremidade 3’<ref name=":1" />. A sonda se liga ao DNA de interesse quando este está em sua forma desnaturada. Quando a sonda está intacta, o ''quencher'' impede a emissão de sinal pelo repórter. Durante a fase de amplificação, a atividade de nuclease da DNA polimerase hidrolisa o oligonucleotídeo da sonda ligada ao DNA, de modo que o repórter e o ''quencher'' são separados e sinal fluorescente é emitido<ref>{{Citar web |url=https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/how-taqman-assays-work.html |titulo=How TaqMan Assays Work - US |acessodata=2021-01-06 |website=www.thermofisher.com |lingua=en}}</ref>. 

== Quantificação ==
[[Ficheiro:Qpcr-cycling.png|miniaturadaimagem|236x236px|Limiar do Ct. O valor de Ct corresponde ao número do ciclo no qual a curva de PCR cruza o limiar. O limiar é representado pela linha horizontal vermelha. As curvas de PCR à esquerda apresentam menor Ct.]]
Os dados de qPCR podem ser analisados como quantificação absoluta ou relativa. Na quantificação absoluta, o número total de cópias do produto do PCR é obtido após comparação com uma curva padrão. 

Já na quantificação relativa, no qual o sinal da sequência de interesse é comparado com o de um controle, sendo o método do 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup> o mais utilizado<ref name=":2">{{Citar periódico |titulo=Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method |url=https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1046202301912629 |jornal=Methods |data=2001-12 |paginas=402–408 |numero=4 |acessodata=2021-01-06 |doi=10.1006/meth.2001.1262 |lingua=en |primeiro=Kenneth J. |ultimo=Livak |primeiro2=Thomas D. |ultimo2=Schmittgen}}</ref>. Para este método, mede-se o valor de Ct, que é o número do ciclo em que o sinal de fluorescência emitido durante o qPCR atinge um limiar significantemente acima da fluorescência de fundo. Menores valores de Ct indicam maiores níveis de expressão, pois são necessários menos ciclos de amplificação para atingir o limiar. Já maiores valores de Ct indicam menores níveis de expressão<ref name=":3">{{citar web |ultimo= |primeiro= |url=https://genomique.iric.ca/resources/files/Understanding_qPCR_results |titulo=Understanding qPCR results |data= |acessodata= |publicado=Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal}}</ref>.

É necessário medir os valores de ''Ct'' do gene-alvo e de um gene de expressão endógena, o qual geralmente é um [[gene de manutenção]]. Um exemplo de gene endógeno frequentemente utilizado é a [[Actina|β-actina]]. Os valores de ''Ct'' devem ser medidos em condições de tratamento e de controle. A equação para quantificação por 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup> é<ref name=":2" />:

<math>quantidade\ relativa = 2^{-\Delta\Delta Ct}</math>

Sendo que:

<math>-\Delta \Delta Ct = \Delta Ct_{tratamento} - \Delta Ct_{controle}</math>


<math>\Delta Ct = Ct_{gene\ de\ interesse} - Ct_{gene\ end\acute{o}geno}</math>

2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup>  corresponde ao valor de ''fold-change'' dos níveis de expressão durante o tratamento em relação ao controle. Um valor de 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup>  igual a um indica níveis de expressão semelhantes entre o tratamento e a condição controle, valores significantemente maiores que 1 indicam expressão aumentada no tratamento, e valores significantemente abaixo de 1 indicam expressão gênica diminuída no tratamento<ref name=":3" />. O valor de 2<sup>−ΔΔ''Ct''</sup>  não possui unidade.

== Referências ==
<references />

== Ver também ==
* [[RT-PCR|Reverse transcription polymerase chain reaction]]

== Ligações externas ==
{{commons|Polymerase chain reaction}}
* {{link|en|2=http://www.sabiosciences.com/manuals/RT-PCR-article.pdf|3=Real-Time PCR for Systems Biology}}

{{Portal3|Biologia}}

{{DEFAULTSORT:Pcr Quantitativo Em Tempo Real}}
[[Categoria:Técnicas em biologia molecular]]